نام اختصاری:

Hepatitis B Virus Genotype

سایر نام ها:

HBV Genotyping, HBVGeno, HBV Polymerase Chain Reaction/Sequencing

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: سرم یا پلاسما

حجم نمونه مورد نیاز: ml 1

شرایط نمونه گیری:

1. نیاز به ناشتایی ندارد.
2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1. لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های جمع کننده یا پلاستیکی استریل و یا لوله های حاوی ماده ضد انعقاد صورت گیرد.
2. ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.
3. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
4. از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
5. پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج RNA و PCR می باشد، در ºC 20 – نگهداری شود.
6. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
7. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
2.  قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
3.  در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

1. سرم یا پلاسما باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری جدا سازی شده و تا زمان انجام  آزمایش، در دمای ºC 20 – نگهداری شود. 
2.  جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
3. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20 – فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

تعیین ژنوتیپ HBV در سیر بیماری، شدت بیماری و پاسخ به درمان (رژیم دارویی) تاثیر گذار است.

اطلاعات تکمیلی:

ویروس هپاتیت B یکی از مشکلات عمده بهداشتی در سطح جهان است که به بیش از 1 میلیون مرگ در طول سال منجر می شود. براساس گزارش سازمان بهداشت جهانی،2 میلیارد نفر در سطح جهان با این ویروس تماس پیدا کرده اند که در درحال حاضر 400 میلیون نفر در سرتاسر جهان با عفونت مزمن هپاتیت B زندگی می کنند (75% در آسیا). 40-15 درصد  این بیماران به سمت هپاتیت مزمن، سیروز و سرطان کبد پیشروی می کنند.

هپاتیت B یک ویروس پوشش دار با تقارن بیست وجهی و متعلق به خانواده هپادناویریده است. ژنوم ویروس، دارای DNA  دو رشته ای حلقوی ناقص است و kb 2/3 طول دارد. ژنوم ویروس هیچ انکوژنی را کد نمی کند و به طور غیرمستقیم سرطان زا می باشد به عبارت دیگر ویروس می تواند با القای فعالیت انکوژنی سلول باعث ایجاد سرطان شود که این امر با الحاق  DNA ویروس در ژنوم میزبان و ناپایدار کردن ژنتیکی آن و نیز نقص ایمنی میزبان صورت می گیرد.

8 ژنوتیپ مختلف A-H بر مبنای اختلاف در 8% از توالی ژنوم شناسایی شده اند در حالیکه زیر ژنوتیپ ها حداقل در 4% از توالی ژنوم با یکدیگر اختلاف دارند. ژنوتیپ های HBV دارای توزیع جغرافیایی متفاوتی هستند بطوریکه ژنوتیپ A عمدتا در شمال امریکا، شمال و شرق اروپا و مناطق مرکزی افریقا، ژنوتیپ B و C عمدتاً در کشور های جنوب شرق آسیا، ژنوتیپ Dدر ناحیه مدیترانه، هند، خاورمیانه و شمال امریکا، ژنوتیپ E در جنوب صحرای آفریقا، ژنوتیپ F در ناحیه جنوبی و مرکزی آمریکا و نیز آلاسکا، ژنوتیپ G در ناحیه جنوبی و مرکزی آمریکا شایع بوده و ژنوتیپ H به آمریکای مرکزی، کالیفرنیا و مکزیک محدود می باشد.

توزیع این ویروس به لحاظ اپیدمیولوژی در سراسر جهان در سه دسته گروه بندی می شود. مناطقی با آندمی بالا^[1] همچون آسیای جنوب شرقی، چین، صحرای آفریقا و آمازون که بیش از 8% از جمعیت، حاملین مزمن HBV
می باشند و95-70 درصد از جمعیت این مناطق با این ویروس مواجهه داشته اند. اکثر این عفونت ها در دوران نوزادی و کودکی رخ می دهند. مناطقی با  آندمی میانه^[2]  همچون اروپای جنوبی و شرقی، خاورمیانه، ژاپن و منطقه ای از امریکای جنوبی که حدود 7-2 درصد از آنها حاملین مزمن HBV و60-10 درصد افراد با این ویروس مواجهه داشته اند در این موارد عفونت اکثراً در زمان بلوغ و نوجوانی رخ  می دهد و نهایتاً مناطقی با آندمی پایین^[3] همچون امریکای شمالی و غربی و استرالیا که فقط 2-5/0 درصد از جمعیت حاملین مزمن هستند و ویروس بیشتر از راه تزریق داخل وریدی و تماس جنسی و همودیالیز انتقال می یابد. یک مطالعه در ایران نشان داد که 35% جمعیت ایران با این ویروس آلوده بودند. پس از اجرای برنامه کنترل و اجرای واکسیناسیون عمومی، شیوع این عفونت به کمتر از 2% کاهش یافت.

ژنوتیپ ویروس هپاتیت B می تواند دوره بیماری، شدت بیماری، پاسخ به درمان و واکسیناسیون را تحت تاثیر قرار دهد. ژنوتیپ های ویروس هپاتیت Bویژگی های بیولوژکی متفاوتی دارند و می توانند بیان متفاوت آنتی ژن های ویروسی را داشته و پاسخ ایمنی را تحت تاثیر قرار دهند. بنابراین تشخیص دادن ژنوتیپ های ویروس هپاتیت B در یک کشور مهم
 می با شد.

روش مرجع:

Sequencing and phylogenetic analysis

روش ارجح:

Multiplex polymerase chain reaction (Multiplex PCR)

سایر روشها:

Restriction fragment polymorphism (RFLP)

مقادیر طبیعی: DNA ی ویروسدر نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.

مقادیر مرجع: -

تفسیر:

تمامی ژنوتایپ های هپاتیت B توانایی آلوده کردن انسان را دارند که منجر به عفونت حاد یا مزمن با درجات متفاوتی از پیشرفت به سمت بیماری کبدی از جمله سیروز و سرطان کبد و در نهایت مرگ می شود. میزان بروز و پیشرفت بیماری کبدی پیشرفته تحت تأثیر عوامل محیطی ویروسی و میزبانی از یک ژنوتیپ به ژنوتیپ دیگر ممکن است متفاوت باشد.

به طور کلی ژنوتیپ های D و C بیماری شدیدتری را نسبت به ژنوتیپ های A و B ایجاد می کنند. مطالعات نشان داده اند که بیماران آلوده شده به ژنوتایپ های A و C با احتمال بیشتری نسبت به ژنوتایپ های B و D به سمت مزمن شدن پیشرفت می کنند اما با این وجود تمامی ژنوتایپ های ویروس هپاتیت B توانایی ایجاد عفونت مزمن را دارند.

سروکانورژن HBeAg و سروکلیرانس HBsAg به عنوان یک اتفاق مهم در دوره عفونت مزمن هپاتیت B در نظر گرفته
 می شود که بروز سالیانه آنها به ترتیب 12% و 2% ارزیابی شده است. سروکانورژن HBeAg در مراحل اولیه بیماری با نتایج رضایت بخش همراه می باشد در حالی که پایدار ماندن HBeAg یا به تأخیر افتادن آن، به پیشرفت بیماری به سمت سیروز کمک نموده و پیامدهای بدی را به همراه دارد.

نتایج مطالعات نشان داد که بیماران آلوده شده با ژنوتایپ C ویروس میزان پایین تر منفی شدن HBeAg را نسبت به ژنوتایپ B ویروس نشان می دهند. چندین مطالعه نشان دادند که منفی شدن آنتی ژن e در بیماران آلوده شده با ژنوتایپ C یک دهه نسبت به بیماران آلوده شده با ژنوتایپ B، دیرتر است. بیماران آلوده شده با ژنوتایپ C زمان طولانی تری نسبت به بیماران آلوده شده با ژنوتایپ B، ویروس را به حالت فعال در سلول های کبدی خود دارند و به این ترتیب با احتمال بیشتری به سمت فیبروز، سیروز و سرطان کبد پیشرفت می کنند. مطالعات نیز نشان داد که سیروز و سرطان در بیماران آلوده شده با ژنوتایپ C ویروس نسبت به ژنوتایپ B متداول تر است. بیماران آلوده شده با ژنوتایپ A ویروس هپاتیت B درصد بالاتری از سروکانورژن آنتی ژن e و سروکلیرانس آنتی ژن s نسبت به بیماران آلوده شده با ژنوتایپ D نشان می دهند و بهبودی مارکرهای بیوشیمیایی و منفی HBV DNA در آنها با درصد بالاتری صورت می پذیرد. به طور کلی افراد آلوده شده با ژنوتایپ D ویروس، بیماری شدیدتری را نسبت به افراد آلوده شده با ژنوتایپ A ویروس ایجاد می کنند و مرگ ناشی از بیماری کبدی در افراد آلوده شده با ژنوتیپ D ویروس بیشتر از ژنوتیپ A ویروس است.

 برخی از بیماران مبتلا به هپاتیت B مزمن که HBeAg منفی هستند، از بیماری های فعال کبدی رنج می برند. سطح ALT این بیماران بالا بوده و HBV DNA در سرم این بیماران قابل جداسازی است. این دسته از بیماران مزمن HBeAg منفی به طور متداول با جهش های ناحیه (G1896A) precore و core  ژنوم ویروس در ارتباط هستند که در این بیماران سنتز آنتی ژن e متوقف می کند.

ژنوتیپ های C, D, E, G و B ویروس هپاتیت B دچار جهش در ناحیه precore می شوند در صورتی که ژنوتیپ های F, H و A به ندرت متحمل چنین جهشی می شوند. مطالعات انجام شده نشان داد که میزان شیوع precore موتانت ها در بیماران آلوده شده با ژنوتایپ D 55%، ژنوتایپ B 44% و ژنوتایپ C 22% است در صورتی که این میزان در بیماران آلوده شده با ژنوتایپ A تنها 3% گزارش شد. این جهش بسیار مهم است به جهت آنکه درمان این بیماران با مشکل مواجه شده و بیمار به سمت سیروز کبدی پیشرفت می کند.

مطالعات نشان داد که ژنوتیپ F ویروس هپاتیت B با بیماری شدید و بروز سرطان کبد در سنین پائین در ارتباط است. میانگین سنی بروز سرطان کبد در بیماران آلوده شده با ژنوتیپ F ویروس تنها 5/22 سال بوده در صورتیکه این میزان در ژنوتیپ های دیگر ویروس 60 سال گزارش شده است. مرگ ناشی از بروز بیماری های کبدی در بیماران آلوده با ژنوتیپ F ویروس بیشتر از سایر ژنوتیپ ها گزارش شده است.

هدف از درمان بیماران مبتلا به هپاتیت مزمن B، تبدیل حاملین فعال بیماری به حاملین غیرفعال بیماری است بطوریکه بیماران HBeAg منفی شوند و HBV DNA در آنها غیرقابل جداسازی شود و بیماران دارای سطح نرمال
 آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) باشند.

 ژنوتیپ های متفاوت ویروس هپاتیت B پاسخ های متفاوتی به رژیم های دارویی نشان می دهند. مطالعات نشان داد بیماران آلوده شده با ژنوتیپ B ویروس نسبت به ژنوتیپ C ویروس پاسخ بهتری نسبت به درمان با اینترفرون نشان
می دهند (41% در مقابل 15%) و بطور مشابه بیماران آلوده شده با  ژنوتیپ A ویروس نیز پاسخ بهتری به درمان با اینترفرون نسبت به بیماران آلوده شده با ژنوتیپ D ویروس نشان می دهند (33% در مقابل 11%). بر این اساس میزان منفی شدن HBeAg در بیماران آلوده شده با ژنوتیپ A و B ویروس بالاتر از بیماران آلوده شده با ژنوتیپ C و D  ویروس می باشد. رابطه HBV ژنوتایپ و درمان بواسطه لامی ودین به مطالعات کم با تعداد نمونه های کم محدود می شود. بنابراین بطور قطعی نمی توان در مورد ارتباط بین درمان با لامی ودین و ژنوتایپ ویروس اظهار نظر کرد و به مطالعات بیشتر با تعداد نمونه های بیشتر نیاز است. مطالعات انجام شده در ایران نشان داد که ژنوتیپ D تنها ژنوتیپ جدا شده از بیماران مبتلا به اشکال متفاوت بیماری هپاتیت B از جمله حاملین مزمن، بیماران متبلا به سیروز و سرطان کبد است.

بهترین روش جهت تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت B تعیین توالی ژنوم ویروس است اما این روش گران و زمان بر می باشد. از روش Multiplex PCR و Restriction fragment polymorphism (RFLP) نیز جهت تعیین ویروس استفاده می شود که Multiplex PCR دارای دقت بالاتری نسبت به RFLP است (%93 در مقابل %87).

عوامل مداخله گر :

• هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
• نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
• فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.
• سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

توضیحات:

• نتیجه «Undetected» نشان میدهد که DNA ویروس هپاتیت  (HBV) Bدر نمونه یافت نشده است.
• ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونتHBV باید با آزمایشات سرولوژیک HBVآغازگردد.
• تشخیص عفونت مزمن  HBVو در نتیجه تعیین ژنوتایپ ویروس با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجشDNA  ویروس در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.
• در صورت عدم وجود DNA ویروس در نمونه سرم بیمار و مثبت بودن HBV-Ab، احتمال آلودگی به ویروس HBV رد نمی گردد.

منابع :

1. Bassem S.S. Guirgis, Radwa O. Abbas, Hassan M.E. Azzazy. Hepatitis B virus genotyping: current methods and clinical implications. International Journal of Infectious Diseases 14 (2010) e941–e953.
2. Chien-Hung Chen, Chuan-Mo Lee, Sheng-Nan Lu, Chi-Sin Changchien, Hock-LiewEng, Chao-Min Huang, Jing-Houng Wang, Chao-Hung Hung, Tsung-Hui Hu. Clinical Significance of Hepatitis B Virus (HBV) Genotypes and Precore and Core Promoter Mutations Affecting HBV e Antigen Expression in Taiwan. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec. 2005, p. 6000–6006
3. ToumyGuettouche, H James Hnatyszyn.Chronic hepatitis B and viral genotype: the clinical significance of determining HBV genotypes.2005. International Medical Press 1359-6535
4. Shuping Tong1, Jisu Li, Jack R Wands , Yu-mei Wen. Hepatitis B virus genetic variants: biological properties and clinical implications. Emerging Microbes and Infections (2013) 2, e10; doi:10.1038/emi2013.10
5. Norio Akuta ,HiromitsuKumada. Influence of hepatitis B virus genotypes on the response to antiviral therapies.Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2005) 55, 139–142.
6. CHI-JEN CHU, ANNA S. F. LOK. Clinical Significance of Hepatitis B Virus Genotypes. HEPATOLOGY, Vol. 35, No. 5, 2002
7. Chih-Lin Lin, Jia-Horng Kao. The clinical implications of hepatitis B virus genotype: Recent advances. Journal of Gastroenterology and Hepatology 26 (2011) Suppl. 1; 123–130.
8. ArezooAghakhani , RasoolHamkar , NastaranZamani , Ali Eslamifar , Mohammad Banifazl , AlirezaSaadat , MasoomehSofian , LadanAdibi , NematIrani , MatinMehryar , Hassan Mohammad HosseiniAkbari , Seyed Mohammad JavadPurkhayat , AmitisRamezani. Hepatitis B virus genotype in Iranian patients with hepatocellular carcinoma. International Journal of Infectious Diseases (2009) 13, 685—689
9. Mohammad Reza Haghshenas, Mohsen Arabi, TahooraMousavi. Hepatitis B Genotypes in Iran. Mater Sociomed. 2014 Apr; 26(2): 129-133
10. SamadAmini-Bavil-Olyaee, RaminSarrami-Forooshani, FereidounMahboudi, FarzanehSabahi, Ahmad Adeli, BabakNoorinayer, Mohammad Azizi,Mohammad Reza Zali.
11. Genotype Characterization and Phylogenetic Analysis of Hepatitis B Virus Isolates From Iranian Patients. Journal of Medical Virology 75:227–234 (2005)