نام اختصاری:M.tuberculosis Complex PCR  

سایر نام ها:

Acid-Fast Bacilli (AFB) PCR, Bacillus: Acid-Fast PCR, MTB (Mycobacterium tuberculosis) PCR, TB (Tuberculosis) PCR, Tubercle Bacilli: Mycobacterium tuberculosisPCR

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری:

مایعات بدن نظیر مایع مغزی نخاعی (CSF)، مایع مفصلی، مایع معده و مایع صفاقی، نمونه های تنفسی شامل خلط، ترشحات برونش ها و BAL (bronchoalveolar lavage fluid)، مدفوع، بافت که می تواند به صورت تازه یا پارافین شده باشد، استخوان، مغز استخوان و یا ادرار.

حجم نمونه مورد نیاز:

مایعات بدن نظیر مایع آسپیره شده از مغز استخوان، مایع نخاعی (CSF) و غیره ml1،

مایع حاصل از شستشوی معده 10 ml،

 نمونه های تنفسی شامل خلط، ترشحات برونش ها و BAL، ml3،

 مدفوع gr 10–5 ، ادرار ml 2 

بافت شامل بافت تازه، پارافینی، استخوان و بیوپسی استخوان mm10–5،

شرایط نمونه گیری:

1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.
3. برای تهیه نمونه از خلط، ابتدا باید بیمار دهانخود را با آب شستشو داده و سرفه‏های عمیق انجام دهد. خلط صبحگاهی یا خلطی که با تحریک سرم نمکی فیزیولوژیک و از طریق بخور تهیه می‏گردد برای آزمایش مناسب‏تر است. از آسپیرة معده، برونشیال یا نای نیز می‏توان به عنوان نمونه استفاده نمود.

ملاحظات نمونه گیری:

1. از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
2. در صورت استفاده از خون یا پلاسما به عنوان نمونه مورد آزمایش، باید EDTAیا سیترات را جهت جلوگیری از انعقاد به کار برد.
3. پس از نمونه گیری باید وسایل مورد استفاده را در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری کرده و ضد عفونی نمود.
4. پس از گرفتن نمونه، باید آن را در یخچال قرار داده و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در دمای4 ºC نگهداری شود ولیکن برای نگهداری نمونه به مدت طولانی تر باید آن را در دمای ºC20- فریز کرد.
5. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
6. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
2.  قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
3.  در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

1. نمونه های مورد استفاده را می توان در دمای یخچال نگهداری نمود و باید از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
2. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
3. نمونه مورد آزمایش را می توان تا 7 روز در دمای یخچال نگهداری نمود.

کاربردهای بالینی:

تشخیص زود هنگام و به موقع مبتلایان  به عفونت سل، جهت انجام اقدامات درمانی مناسب و مدیریت بیماری و جلوگیری از عوارض ناشی از آن.

اطلاعات تکمیلی:

سل یکی از مهم ترین بیماری های عفونی در سراسر جهان است که در اثر آلودگی با باکتریهای گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایجاد می شود. حدود 2 میلیارد نفر یعنی تقریباً یک سوم جمعیت جهان به این باکتری آلوده اند. هر ساله نزدیک به 9 میلیون نفر به سل مبتلا می شوند و در حدود 2 میلیون نفر در نتیجه ابتلاء به این بیماری می میرند.

مایکوباکتریوم ها، باکتری های میله ای شکل هوازی هستند و اسپور تشکیل نمی دهند. اگرچه این باکتریها به سهولت رنگ آمیزی نمی شوند، اما بعد از رنگ آمیزی، حذف رنگ توسط اسید یا الکل مشکل است از این رو، آنها را باسیل های اسیدفست (مقاوم در برابر اسید) می نامند. مایکوباکتریوم ها هوازی اجباری بوده و انرژی مورد نیاز خود را از اکسیداسیون مواد کربن دار ساده به دست می آورند. زمان رشد این باکتری ها بسیار آهسته تر از سایر باکتریها است.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می تواند از طریق تنفسی از فرد آلوده به فرد سالم منتقل شود و اگر افراد آلوده به موقع شناسایی نشده و تحت درمان ضد باکتریایی صحیح قرار نگیرند، باکتری پتانسیل بالایی جهت مقاوم شدن به آنتی بیوتیک ها دارد. لذا تشخیص سریع و دقیق سل در بیماران از اهمیت بالایی برخوردار است.

روش مرجع:کشت باکتری

روش ارجح:ردیابی ژنوم باکتری به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از تکنیک Real Time PCR

سایر روشها: رادیوگرافی ریه،اسمیر و کشت خلط، تست توبرکولین، تست های سرولوژیکی و روشهای مولکولی.

مقادیر طبیعی:DNA باکتری توبرکلوزدر نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.

محدوده قابل سنجش:حساسیت تشخیص تست، یک کپی در میکرولیتر می باشد یعنی در 95 درصد مواردی که تیتر مایکوباکتریوم در نمونه مورد آزمایش بیشتر از این میزان باشد، تشخیص داده خواهد شد.

تفسیر:

هم چنان که پیشتر ذکر شد، سل یکی از بیماری های عفونی بالقوه کشنده است و شیوع آن در سراسر جهان، خطر جدی برای زندگی بشر محسوب می شود. در تشخیص عفونت سل عوامل متعددی نظیر اپیدمیولوژی بیماری در منطقه، تاریخچه بیمار، علائم بالینی، رادیوگرافی ریه، اسمیر و کشت خلط، تست های پوستی، آزمایشات بیوشیمیایی و روشهای مولکولی نظیر PCR اهمیت دارند ولیکن سرعت و دقت در تشخیص بیماری یکی از مسائل جدی محسوب می شود. روش رنگ آمیزی مستقیم از دقت و حساسیت پایینی برخوردار است و کشت خلط بسیار زمان بر است. بنابراین استفاده از روشی آسان و حساس، به عنوان مکمل و در جهت تأیید تشخیص بالینی لازم و ضروری است. از این رو روش Real time PCR، به عنوان روشی مؤثر و سریع جهت تشخیص به موقع و انجام اقدامات درمانی مناسب مورد توجه می باشد.

ردیابی پاتوژن به وسیله Real time PCR، بر اساس تکثیر نواحی اختصاصی از ژنوم باکتری صورت می گیرد. در این روش محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود که این امر عموماً  به واسطه پروب های الیگونوکلئوتیدی که به طور اختصاصی به محصول تکثیر یافته متصل می شوند، صورت می گیرد. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR (یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، محصول جمع شده را ردیابی نموده و کمیت آن را نیز تعیین نمائیم.

عوامل مداخله گر :

• هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
• نمونه گیری در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
• فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات:

• نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA باکتری در نمونه یافت نشده است.
• نتایج کمی بیان شده به واحد copy/mlنشان دهنده میزان فعالیت باکتری و تکثیر آن در بیمار است.
• نتایج کمی بر پیشرفت بیماری و یا پاسخ به درمان ضد باکتریایی نظارت می کند.
• تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA ی باکتری در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.
• در صورت عدم ردیابی DNA پاتوژن در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به عفونت باکتریایی رد نمی گردد چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسیدنوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته ‌باشد.         

منابع :

1. سایت مایو کلنیک:  http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/88807.
2. میکروبیولوژی پزشکی جاوتز، گنو اف. بروکس، ت مهدی خزعلی، نشر حیان، 2004ISBN: 964-460-800-3
3. کیت TB RG، جهت تشخیص و کمیت سنجی گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس به روش Real – Time PCR، Novin Gene.
4. مهدی روحانی، احمد خورشیدی، رضوان منیری، مهناز طرفه، فاطمه عبدالشاه، محمود صفاری، غلامرضا شجری، غلام عباس موسوی. تشخیص سریع کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس: روش PCR با استفاده از قطعه الحاقی 6110. مجله دانشکده پزشکی، دانشگاه علولم پزشکی تهران، دوره 67، شماره 3، خرداد 1388، 177-173.
   1. Artus, M. tuberculosis RG PCR Kit Handbook, QIAGEN