نام اختصاری:Toxoplasma gondii PCR  

سایر نام ها:

T. gondii PCR

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری:بر اساس منبع آلودگی می تواند خون، سرم، مایع آمنیوتیک، مایع نخاع (CSF)، مایع چشمی و یا بافت تازه باشد. برای ردیابی عفونت های مادرزادی توصیه می شود از مایع آمنیوتیک جهت ردیابی DNA توکسوپلاسما استفاده شود.  

حجم نمونه مورد نیاز: خون 5 ml ، مایعات بدن 1 ml ، مایع آمنیوتی 5 ml

شرایط نمونه گیری:

1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1. لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های جمع کننده یا پلاستیکی استریل صورت گیرد و برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود.
2. ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTAیا سیترات باشد.
3. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
4. از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
5. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
6. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
2.  قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
3.  در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

1. نمونه های مورد استفاده باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای یخچال یا ºC 20 – قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
2.  جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

کاربردهای بالینی:

تشخیص زود هنگام عفونت مغزی حاد، چشمی و توکسوپلاسموز مادرزادی جهت انجام اقدامات درمانی به موقع و مناسب.

اطلاعات تکمیلی:

توکسوپلاسما گوندی نوعی تک یاخته کوکسیدیایی است که دارای انتشار وسیعی در سراسر جهان بوده و عامل ایجاد بیماری مشترک بین انسان و حیوان می باشد. میزان شیوع عفونت توکسوپلاسمایی در ایران نیز قابل توجه است. آلودگی با توکسوپلاسما در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، معمولاً بدون ظهور علائم بالینی است ولیکن آلودگی به این تک یاخته در دوران بارداری، می تواند منجر به مرگ جنین، زایمان زودرس و توکسوپلاسموز مادرزادی شود.

گربه به عنوان مهم ترین عامل انتقال این عفونت به انسان شناخته شده است به همین دلیل به بیماری توکسوپلاسموزیس، عنوان بیماری گربه نیز داده اند. قسمت اصلی زندگی انگل که همان دوره جنسی انگل و ایجاد تخم است، در بدن گربه صورت می گیرد. سپس تخم ها از مدفوع گربه دفع می شوند و به میزبان واسط می رسند. گربه آلوده هر روز صد میلیون انگل را دفع می کند که در شرایط مساعد تا سال ها در خاک زنده می مانند. انسان ها از طریق خوردن مواد غذایی آلوده به مدفوع گربه یا خوردن گوشت دام آلوده مثل گوسفندی که قبلا تخم های انگل را خورده و انگل در ماهیچه یا مغز دام به صورت کیست در آمده، به این بیماری مبتلا می شوند.

خطر اصلی این بیماری، انتقال از مادر به جنین است که می تواند باعث ناهنجاری های مختلف چشمی و مغزی در نوزاد شود. این ارگانیسم در انسان می تواند منجر به ایجاد توکسوپلاسموز نوزادی یا مادرزادی شود. توکسوپلاسموز مادرزادی یکی از علل اصلی کوری و سایر نقایص مادرزادی نظیر مرده زایی، کوریورتینیت (التهاب مشیمیه و شبکیه)، کلسیفیکاسیون داخل مغزی، صدمات حرکتی – روانی و هیدروسفالی یا میکروسفالی می باشد.

روش مرجع:  ایمیونوفلوئورسانس غیر مستقیم (IFA)

روش ارجح: IFA ، کمی لومینوسانس

سایر روشها:

1. روش های مولکولی نظیر PCR که بر اساس ردیابی DNAی انگل در نمونه بیمار صورت می گیرند
2. روش های پارازیتولوژی که جهت مشاهده انگل به کار می روند
3. روش‌هاى سرولوژى که براى جستجو و تعيين مقدار پادتن‌هاى اختصاصى توکسوپلاسما کاربرد دارند. از میان روش های سرولوژی، آزمون رنگى سابين فلدمن  (Sabin-Feldman dye test)و آزمون فلوئورسنت پادتن غيرمستقيم(Indirect fluorescent antibody)کاربرد وسيع تری دارند ولیکن آزمايش‌هاى ديگر نظیر ثبوت مکمل
   (Complement Fixation-CF)، آزمايش هماگلوتيناسيون غيرمستقيم(Indirect hemagglutination)، آگلوتيناسيون مستقيم و الايز (Enzyme Linked Immunosorbetn Assay-ELISA) نيز براى تشخيص توکسوپلاسموز استفاده مى‌شوند.

مقادیر طبیعی:DNAی انگل توکسوپلاسما در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست حتی اگر این افراد قبلاً در معرض عفونت قرار گرفته باشند. 

نکته:میزانDNAی انگل در نمونه مورد آزمایش باید به اندازه ای باشد که پس از تکثیر توسط واکنش PCRقابل ردیابی باشد.

تفسیر:

توکسوپلاسموزیس نوعی عفونت انگلی مشترک بین انسان و حیوانات گرم است که دارای شیوع بالایی در سرا سر دنیا است. به منظور جلوگیری از بروز عوارض متنوع ناشی از عفونت توکسوپلاسمایی نظیر سقط جنین و اختلالات عصبی و بینایی، تشخیص به موقع عفونت و انجام اقدامات درمانی مناسب بسیار حائز اهمیت است.

روش های گوناگونی نظیر کشت انگل، روشهای سرولوژیکی و مولکولی جهت بررسی نمونه های بالینی از نظر آلودگی به عفونت توکسوپلاسمایی مورد استفاده قرار می گیرند. روش جداسازی انگل با استفاده از تلقیح حیوانی یا کشت سلولی بسیار طولانی و زمان بر است و برای تشخیص سریع چندان کارامد نیست. روش های سرولوژیکی در افرادی با ضعف ایمنی نظیر جنین می تواند منجر به ایجاد نتایج غیر قابل اعتماد شود همچنین در بسیاری از موارد قادر به تفکیک عفونت قبلی از عفونت حاد نمی باشد ولیکن، ردیابی ژنوم انگل به وسیله تکنیک PCR به عنوان روشی با حساسیت و ویژگی بالا شناخته شده است.

تکنیک PCR که وجود اسید نوکلئیک توکسوپلاسما را در مایع آمنیوتیک بررسی می کند، دارای حساسیت بسیار بالاتری نسبت به اندازه گیری IgM در مایع آمنیوتیک از طریق آمنیوسنتز می باشد و لذا می تواند به عنوان روشی سریع و مؤثر جهت تشخیص به موقع عفونت در زنان باردار مورد استفاده قرار گیرد.

در تکنیک Real time PCR نواحی اختصاصی از ژنوم انگل تکثیر می یابد و محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR (یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، نتیجه آزمایش را بررسی نموده و از وجود یا عدم وجود DNAی انگل در نمونه مورد آزمایش مطمئن شویم.

عوامل مداخله گر :

• هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
• نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
• برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR از هم جدا باشند.

توضیحات:

• نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNAی انگل در نمونه یافت نشده است.
• تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص DNAی انگل در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.
• در صورت عدم ردیابی DNAی انگل در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به عفونت با توکسوپلاسما رد نمی گردد.

منابع :

1. سایت مایو کلنیک:  http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Specimen/81795.
2. میکروبیولوژی پزشکی جاوتز، گنو اف. بروکس، ترجمه دکتر مهدی خزعلی و مریم جنابی نمین، نشر حیان، 2004ISBN: 964-460-800-3
3. اسماعیل فلاح، رضا نوازش، جعفر مجیدی، حسین کوشاور، نسرین مهدی پور زارع. بررسی اپیدمیولوژیکی آلودگی به توکسوپلاسما در دختران دبیرستانی شهرستان جلفا. فصل نامه باروری و ناباروری. تابستان 1384. صفحات 269 – 261.
   1. Paula Vieira Teixeira Vidigal, Daniel Vitor Vasconcelos Santos, et. al. (2002). Prenatal toxoplasmosis diagnosis from amniotic fluid by PCR. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 35(1):1-6.